Aqueous Extract of Red Deer Antler Promotes Hair Growth by Regulatingthe Hair Cycle and Cell Proliferation in Hair Follicles.Водный экстракт пантов марала способствует росту волос путем регулирования цикла волос и клеточной пролиферации в волосяных фолликулах.

The Scientific World Journal
Volume 2014 (2014), Article ID 878162, 7 pages
http://dx.doi.org/10.1155/2014/878162

Research Article

Aqueous Extract of Red Deer Antler Promotes Hair Growth by Regulating the Hair Cycle and Cell Proliferation in Hair Follicles

Jing-jie Li, Zheng Li, Li-juan Gu, Yun-bo Wang, Mi-ra Lee, and Chang-keun Sung

Department of Food Science and Technology, College of Agriculture and Biotechnology, Chungnam National University, 220 Gung-dong, Yusung-gu, Daejeon 305-764, Republic of Korea

Received 9 December 2013; Accepted 7 January 2014; Published 13 February 2014

Academic Editors: G. Y. Anacak and F. S. Hall

Copyright © 2014 Jing-jie Li et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

 

Научный Мировой Журнал

Том 2014 (2014), статья ID878162, 7 страниц

Исследовательская статья

Водный экстракт пантов марала способствует росту волос  путем регулирования цикла волос и клеточной пролиферации в волосяных фолликулах

Джинг-джи Ли, Женг Ли, Ли-джуан Гу, Ян-бо Ванг, Ми-ра Ли и Чанг-кеун Сунг

Департамент Пищевого Исследования и Технологии, Колледж Сельского хозяйства и Биотехнологии, Национальный университет Чангнама, 220 Гунг-Донг, Юсунг-гу, Даджеон 305-764, Республика Корея

Получено 9 декабря 2013; принято 7 января 2014; опубликовано 13 февраля 2014

Научные редакторы: Дж. И. Анакак и Ф.С. Холл

Перепечатано © 2014 Джинг-джи Ли и соавт. Это статья открытого доступа распространяется  Творческим Сообществом Присвоения Лицензии, которое разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, предоставленный оригинал работы должным образом цитируется.

Abstract

Deer antlers are the only mammalian appendage capable of regeneration. We aimed to investigate the effect of red deer antler extract in regulating hair growth, using a mouse model. The backs of male mice were shaved at eight weeks of age. Crude aqueous extracts of deer antler were prepared at either 4°C or 100°C and injected subcutaneously to two separate groups of mice () at 1 mL/day for 10 consecutive days, with water as a vehicle control group. The mice skin quantitative hair growth parameters were measured and 5-bromo-2-deoxyuridine was used to identify label-retaining cells. We found that, in both the 4°C and the 100°C deer antler aqueous extract-injection groups, the anagen phase was extended, while the number of BrdU-incorporated cells was dramatically increased. These results indicate that deer antler aqueous extract promotes hair growth by extending the anagen phase and regulating cell proliferation in the hair follicle region.

Резюме

Панты оленя являются лишь придатком млекопитающих способным к регенерации. Мы стремились исследовать влияние экстракта пантов благородного оленя в регуляции роста волос, используя модель мыши. Спинки самцов мышей брили с восьми недельного возраста.  Неочищенные водные экстракты оленьих  пантов были получены или при 4°С или 100°С и вводили подкожно двум отдельным группам мышей  () 1 мл/день в течение 10 последовательных дней, с водой как средство контрольной группе. Мышиные кожные количественные параметры роста волос были измерены и 5-бром-2-дезоксиуридин был использован для определения клеток сохраняющих метки. Мы обнаружили, что, как при 4°С, так 100°С в группах инъекций водного экстракта оленьих пантов, фаза анагена была продлена, а количество БрдУ-окрашенных включенных клеток резко возросло. Эти результаты показывают, что водный экстракт оленьих пант способствует росту волос путем расширения фазы анагена и регуляции клеточной пролиферации в области волосяного фолликула

  1. Introduction

Deer antlers are the only bony structures in mammals that completely regenerate every year, and velvet is the epidermis covering the inner structure of the growing bone and cartilage, which develops into antler. Each antler grows from a junction point on the skull called the pedicle [1]. Deer antler has a very long history of use in traditional Chinese medicine (TCM). Traditional medical reports and clinical observations suggest that antler velvet is composed of many components, such as chondroitin sulfate, estrone, estradiol, prostaglandins [2], 416 unique proteins such as vimentin [3], and growth factors including insulin-like growth factor-1 [4], and epidermal growth factor [5]. The most important components are insulin-like growth factors (IGFs) that we detected in our previous research [6]. These growth factors increase the rate of cell division, indicating a possible role in cell regeneration and repair processes in humans [7]. In addition, the proliferation effect of deer antler is studied recently [8, 9]. Previously, our research group demonstrated the beneficial effect of deer antler on wound healing in a rat model [10]. In the same study, we coincidentally observed that deer antler extract seemed to have a stimulatory effect on hair regrowth.

To produce new hairs, existing follicles undergo a process which has been defined for the mammalian hair cycle and consists of three phases: anagen, catagen, and telogen [11]. The duration of anagen determines the length of the hair and is dependent upon continued proliferation and differentiation of matrix cells at the follicle base. As the supply of matrix cells declines, differentiation of hair shaft (HS) and inner root sheath (IRS) slow down, and the follicle enters a destructive phase called catagen [12]. Following catagen, follicles lie dormant in a resting phase (telogen). Although no new hair follicles are generated postnatal, the lower portion of the hair follicle regenerates in order to produce a new hair.

Based on previous studies investigating the effect of deer antler on wound healing [10], we found that deer antler extract accelerated hair growth by enhanced IGF-1 expression in wound healing skin [13]. In the current study, we aimed to investigate the further molecular mechanism of deer antler aqueous extract on regulation of the hair cycle and hair follicle cell proliferation.

Введение

Оленьи панты единственные костные структуры у млекопитающих, которые полностью восстанавливаются каждый год, и бархат — это эпидермис, покрывающий внутреннюю структуру растущей костной и хрящевой ткани, которая развивается в панты. Каждый  пант растет из узловой точки на черепе называемой ножкой [1]. Олений пант имеет очень долгую историю использования в традиционной китайской медицине (ТКМ). Традиционные медицинские отчеты и клинические наблюдения свидетельствуют о том, что бархат пант состоит из многих компонентов, таких как хондроитинсульфат, эстрон, эстрадиол, простагландинов [2], 416 уникальных белков, таких как виментин [3], и факторов роста, включая инсулиноподобный фактор роста 1 [4], и эпидермального фактора роста [5]. Наиболее важными компонентами являются инсулиноподобные факторы роста (ИФР), которые мы обнаружили в нашем предыдущем исследовании [6]. Эти факторы роста увеличивают скорость деления клеток, что указывает на возможную роль в регенерации клеток и  восстановления процессов в организме человека [7]. Кроме того, эффект распространения оленьего панта недавно изучен [8, 9]. Ранее наша исследовательская группа продемонстрировала положительный эффект оленьего  панта на заживление ран в крысиной модели [10]. В том же исследовании, мы случайно заметили, что экстракт пантов оленя, оказалось, имеет стимулирующее действие на рост волос.

Для получения новых волосков, существующие фолликулы подвергаются процессу, который был определен для млекопитающих волосяным циклом и состоит из трех этапов: анагена, катагена, и телогена [11]. Продолжительность анагена определяет длину волос и зависит от дальнейшей пролиферации и видоизменения матричных клеток фолликулярной  основы. Так как снабжение ячеек матрицы снижается, дифференциация волосяного стержня (ВС) и рост внутренней оболочки корня (ВОК) замедляется, а фолликула вступает в деструктивную фазу называемую катагеном [12]. После катагена, фолликулы бездействуют в фазе покоя (телогена). Хотя никаких новых волосяных фолликул не генерируются постнатально, нижняя часть волосяной фолликулы регенерирует с целью получения новых волос.

Основываясь на предыдущих исследованиях, изучающих влияние оленьего панта на заживление ран [10], мы обнаружили, что экстракт пантов оленя ускорил рост волос по усилению выражения ИФР-1 в заживлении ран кожи [13]. В текущем исследовании, мы стремились изучить дальнейший молекулярный механизм водного экстракта пант оленя по регулированию цикла волос и волосяных фолликул клеточной пролиферации.

 

  1. Materials and Method

2.1. Preparation of Deer Antler Extract

Four-year-old male red deer (Cervus elaphus), at the early, fast-growing stage of antler development, were obtained from a local deer farm. Analgesia was achieved by intramuscular injection of 20 mg/mL of xylazine hydrochloride at 1 mL/kg of body weight. The antlers were removed by cutting the proximal region using a surgical handsaw [14] and then cut into four sections (tip, upper, mid, and base). Once dissected, tissues from each region were sliced into 0.3 mm pieces using a trephine, snap-frozen in liquid nitrogen within 20 min of removal, and stored at −70°C until further analysis. The tips of antler tissues were homogenized in a Waring blender and then grounded into powder under liquid nitrogen. We used PBS buffer solution and water to extract deer antler, respectively, with different times. Compared to PBS buffer, water was able to extract more lower molecular protein which can be absorbed well, so water was deemed to be a superior extract solution and more suitable for subsequent experiments. To prepare 4°C aqueous extract, 5 g of deer antler powder was extracted in 50 mL of deionized water at 4°C for 1 h. The mixture was centrifuged at 10,000× g for 10 min at 4°C, and then the supernatant was filter-sterilized. Another 5 g deer antler powder was boiled in a water bath in 50 mL deionized water for 1 h to prepare the 100°C extract and the volume was filled up to 50 mL after boiling (since a little liquid was evaporated when boiling). The mixture was centrifuged at 10,000× g for 10 min at 4°C, and then the supernatant was filter-sterilized. Both of the two groups of total crude extract concentration were 100 mg/mL, stored at −70°C and thawed immediately prior to use.

 

  1. Материалы и метод

2.1. Приготовление экстракта из пант оленя

 

На ранней, быстро растущей, стадии развития панты были получены от местного четырехлетнего самца благородного оленя (Сервус елафус) с оленеводческой фермы. Обезболивание было достигнуто путем внутримышечной инъекции 20 мг/мл гидрохлорида ксилазина со скоростью 1 мл/кг массы тела. Панты были удалены путем разрезания проксимальной области с помощью хирургической ножовки [14], а затем  разрезаны на четыре раздела (наконечник, верхний, средний и основание). Сразу рассеченные ткани из каждой области были нарезаны на 0,3 мм кусочки с помощью трепана, быстро заморожены в жидком азоте в течение 20 мин после удаления и хранились при -70°С до дальнейшего анализа. Кончики пант тканей гомогенизировали в смесителе Уоринга, а затем размолоты в порошок в жидком азоте. Мы использовали буферный раствор ПБС и воду для извлечения панта оленя, соответственно, с разными промежутками времени. По сравнению с ПБС буфером, вода была в состоянии извлечь больше низко молекулярного белка, который может хорошо впитываться, поэтому вода была признана лучшим  экстрактным раствора  и больше подходит для последующих экспериментов. Для приготовления 4°С водного экстракта, 5 г порошка панта оленя  экстрагировали в 50 мл деионизированной воды при 4°С в течение 1 ч. Смесь центрифугировали при 10,000 х г в течение 10 мин при 4°С, а затем плавающий на поверхности супернатант стерилизовали с помощью фильтра. Еще 5 г порошка панта оленя кипятили на водяной бане в 50 мл деионизированной воды в течение 1 ч, чтобы подготовить 100°C экстракт и объем доводили до 50 мл после кипячения (небольшое количество жидкости выпаривалось при кипении). Смесь центрифугировали при 10,000 х г в течение 10 мин при 4°С, а затем супернатант стерилизовали с помощью фильтра. Обе из двух групп общей концентрации неочищенного экстракта были 100 мг/мл, хранились при -70°C и оттаивались непосредственно перед использованием.

 

2.2. Animal Treatment

Healthy C57BL/6 male mice purchased from Danhan Biolink Inc. (Korea) were used in all experiments and fed standard mouse chow and water. Animals were housed in polypropylene cages and maintained under standard conditions of a 12 h light/dark cycle, a temperature of °C, and 35–60% humidity. All mice were kept in quarantine for one week prior to experimentation. Care and handling of all animals were done in accordance with guidelines for the care and use of laboratory animals of Chungnam National University. All protocols were approved and monitored by the Ethics Committee of Animal Experiments at Chungnam National University.

Mice in all treatment groups were morphologically preselected to be in the telogen phase (62 days) of the hair growth cycle. To achieve synchronized anagen development over the entire dorsal skin area, all mice were depilated with animal clippers and then treated with a commercial depilatory cream (Bikiro cream, Tai Guk Pharm. Co. Ltd., South Korea). The study included three groups of mice with their backs shaved (): group I was injected with 0.1 mL water only and served as control, group II was injected with 0.1 mL (100 mg/mL) 100°C deer antler aqueous extract (AAE), and group III was injected with 0.1 mL (100 mg/mL) 4°C AAE. All mice were subcutaneously injected into the dorsal skin for 10 consecutive days, started immediately after they were shaved, and sacrificed on the 10th day after depilation. Full-thickness skin samples were harvested, fixed in 4% paraformaldehyde (PFA), dehydrated, and embedded in paraffin for section. The remaining skin samples were stored at −70°C for future experiments.

2.2. Лечение животных

Здоровые C57БЛ/6 самцы мышей, приобретенные у  Данхан БиоЛинк  Инк. (Корея), были использованы во всех экспериментах и кормились стандартным мышиным кормом и водой. Животных содержались в полипропиленовых клетках и поддерживались в стандартных условиях 12 ч циклом свет/темнота, при температуре °С, и 35-60% влажности. Все мыши содержались на карантине в течение одной недели до эксперимента. Уход и обработка всех животных были проведены в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных Чунгнамского национального университета. Все протоколы были одобрены и контролировались Комитетом по этике экспериментов на животных в Чунгнамском национальном университете.

Мыши в группах лечения были морфологически предварительно выбраны  в фазе телогена (62 дня) от цикла роста волос. Для достижения синхронизированного развития анагена, по всей площади дорсальной кожи, все мыши были депилированы ножницами для животных, а затем обрабатывались коммерческим кремом для депиляции (Бикиро крем, Тай Гук  Фарм. Кo. Лтд., Южная Корея). В исследование были включены три группы мышей с выбритыми спинами (): группе I вводили 0,1 мл только воду и служила в качестве контроля, группе II вводили 0,1 мл (100 мг/мл) 100°С водный пантовый олений     экстракт (ВПЭ), и группе III вводили 0,1 мл (100 мг/мл) 4°C ВПЭ. Все мыши были подкожно уколоты в кожу спины в течение 10 дней подряд, начали сразу же после того, как они  были  выбриты, и умерщвляли на 10-й день после депиляции. Образцы кожи на полную толщину собирали, фиксировали в 4% параформальдегиде (ПФК), обезвоженные   заливали в парафин для сегментирования. Остальные образцы кожи хранили при -70°С для будущих экспериментов.

 2.3. Histological Studies

A 12 cm2 patch of dorsal skin was excised between fore and hind legs after injection with AAE at indicated times. Dorsal skin was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) and then embedded in paraffin. Consecutive 3 to 4 μm thick longitudinal and transverse sections were then prepared. Sections were stained with hematoxylin and eosin (HE). Digital photomicrographs were taken from representative areas at the indicated magnification. Follicles were counted manually in the dermis and the subcutaneous layer by a blinded observer at a fixed magnification. Skin thickness from the epidermis to the panniculus carnosus was measured.

2.3. Гистологические исследования

Лоскут 12 cm2 кожи спины вырезали между передней и задней ногами после инъекции с ВПЭ в указанное время. Спинную кожу фиксировали в 4% параформальдегиде (ПФК), а затем заливали в парафин. Затем последовательно от 3 до 4 мкм получались продольные и поперечные срезы. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином (ГЭ). Цифровые микрофотографии были взяты из представленных участков в указанном увеличении. Фолликулы были подсчитаны вручную в дерме и подкожном слое независимым наблюдателем при фиксированной увеличении. Измерялась толщина кожи от эпидермиса к слою скелетной мышцы в поверхностной фасции, образующей подкожную мышцу шеи.

2.4. Statistical Analysis

In HE-stained sections, hair growth data are expressed as mean follicle length ± standard errors of at least three independent experiments performed in triplicate. Regrown hairs were plucked from representative areas in shaved parts of sacrificed mice on the 10th day. Average hair length from 30 hairs per mouse was calculated. Digital photomicrographs were taken from representative areas of slides at a fixed magnification of 100x. All images were cropped in a fixed area with a width of 600 μm. Hair follicles in deep subcutaneous tissue (/mouse) were then manually counted for each group.

Student’s -test was used to assess differences between the values from the various experimental and control groups. Statistical significance was defined as  value < 0.05.

2.4. Статистический анализ

В ГЭ-окрашенные участки, данные роста волос выражены как средняя длина фолликула ± стандартные ошибки, по крайней мере, в трех независимых экспериментах, выполненных в трех экземплярах. Отросшие волосы были выдернуты с представленных участков в бритых частях жертвенных мышей на 10-й день. Средняя длина волос была рассчитана от 30 волосков на мышь. Цифровые микрофотографии были взяты из слайдов  представленных участков с фиксированным увеличением 100х. Все изображения были обрезаны в фиксированной области с шириной 600 мкм. Волосяные фолликулы в глубокой подкожной ткани (/мышь) были затем подсчитаны вручную для каждой группы.

Тест Стьюдента использовался для оценки отличий между значениями различных экспериментальной и контрольной группами. Статистическая значимость определялась как значение <0,05.

2.5. BrdU Labeling

Epithelial cell proliferation was measured by intraperitoneal (i.p.) injection of BrdU (130 μg/g of body weight, Sigma, Korea) 48 h before sacrifice. Dorsal skin was excised and subjected to immunohistochemistry for BrdU. The number of BrdU-positive cells and the total number of cells were determined per 100 μm of interfollicular epithelium in each section. For BrdU immunohistochemistry, paraffin sections were blocked with 1% bovine serum albumin (BSA) and then incubated with BrdU primary antibody for at least 1 h. Slides were washed three times with PBS and then incubated with conjugated secondary antibody for 20 min (Invitrogen, Carlsbad, CA). Finally, the reaction was visualized with diaminobenzidine as a chromogenic substrate for peroxidase. Digital photomicrographs were taken from representative areas of slides at a fixed magnification of 100x by light microscopy. All images were cropped in a fixed area with a width of 600 μm. BrdU-positive cells in the hair matrix area and outer root sheath were then manually counted in a fixed area with a width of 300 μm. In the meantime, we counted the S-phase cell in anagen in different parts of hair follicle as compared: matrix part, hair follicle papilla and hair shaft part. We took the picture at the magnification, of 100x and 400x. Nine sections were reduplicated in each group. Student’s -test was used to assess the differences between groups. All statistical analyses were performed in SPSS, version 18 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

2.5. БрдУ маркировки

Пролиферация эпителиальной клетки измерялась путем внутрибрюшинной (ВБ) инъекции БрдУ-окрашивания (130 мкг/г массы тела, Сигма, Корея) за 48 ч до умерщвления. Спинную кожу вырезали и подвергали иммуногистохимии для  БрдУ-окрашивания. Количество БрдУ-положительных клеток и общее количество клеток определяли на 100 мкм интерфолликулярного эпителия в каждой секции. Для БрдУ-окрашивания иммуногистохимии, парафиновые срезы блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и затем инкубировали с БрдУ-окрашиванием первичными антителами в течение не менее 1 ч. Срезы промывали три раза ПБС и затем инкубировали с конъюгированным вторичным антителом в течение 20 мин («Ген в пробирке»,  Карлсбад,  Ка). Наконец, реакция визуализировалась с диаминобензидином в качестве хромогенного субстрата для пероксидазы. Цифровые микрофотографии были взяты из репрезентативных участков слайдов на фиксированном увеличении 100х с помощью световой микроскопии. Все изображения были обрезаны в фиксированной области с шириной 600 мкм. БрдУ-окрашенные положительные клетки в области волосяного матрикса и внешняя корневая оболочка  затем вручную подсчитывались в фиксированной области с шириной 300 мкм. В то же время, мы посчитали С-фазу клетки анагена в разных частях волосяного фолликула по сравнению: матричной части, волосяного фолликулярного сосочка и волосяную стержневую часть. Мы взяли картину в увеличении 100х и 400x. Девять срезов редуплицировались (удваивались) в каждой группе.  Тест Стьюдента использовался для оценки различий между группами. Все статистические анализы были выполнены в СПСС, версия 18 ( СПСС Инк., Чикаго, Иллинойс, США).

3. Results

3.1. Histological and Quantitative Morphologic Analysis of Hair Follicles

The hair shaft length in the 4°C group was significant longer than control group, while 100°C group showed modest result (Figure 1(a)). Compared with control group, hair follicle diameter measurement in both 4°C group and 100°C group showed significant difference (Figure 1(b)).

 

  1. Результаты

 

3.1. Гистологический и количественноморфологический анализ волосяных фолликул

 

Длина волосяного стрежня в 4°C группе была значительно длиннее, чем в контрольной группе, в то время как 100°С группа показала скромный результат (рис. 1 (а)). По сравнению с контрольной группой, измерение диаметра волосяной фолликулы в обоих 4°C группы и 100°С группе показало значительное различие (рисунок 1 (б)).

 

 

 

Figure 1: HE staining and quantitative morphologic analysis of hair follicles. HE-stained paraffin sections of dorsal skin of control (water) and 100°C or 4°C deer antler extract-treated mice were examined at 100x magnification. (a) Quantitative analysis of the hair shaft length. (b) Hair follicle diameter of the different groups. (c) Thickness of the dermis and epidermis in the different groups. (d) Distance between the hair germ and the subcutaneous layer in the different groups. ((a)–(d) left part) Sections of the back skins were stained, and representative photomicrographs of skin sections are shown. Bars are 100 μm. Values are mean ± standard deviation (SD) (/mouse; * and ** compared to control). Nine sections were reduplicated in each group.

 

 

Рисунок 1:  ГЭ окрашивание и количественноморфологической анализ волосяных фолликул. ГЭ-окрашенные парафиновые срезы контроля спинной кожи (вода) и 100°C или 4°С пантовым оленьим экстрактом обработанные мыши были рассмотрены на 100-кратном увеличении. (а) Количественный анализ длины волосяного стержня. (б) Диаметр волосяной фолликулы в разных группах. (с) Толщина дермы и эпидермиса в различных группах. (d) Расстояние между зародышем волоса и подкожным слоем в различных группах. ((а) — (d) левая часть) Срезы кожи спины окрашивались, и представленные микрофотографии участков кожи показаны. Полосы 100 мкм. Значения представляются средние ± стандартное отклонение (СО) (/мышь; * и ** по сравнению с контролем). Девять срезов редуплицировались в каждой группе.

 

The distance between the hair germ and the subcutaneous layer can be used to determine the phase of hair growth [15]. Based on these measurements, we found that the bulbs of the hair follicles in anagen were more closely associated with adipose tissue in the AAE groups, indicating that follicles penetrated deeper into the subcutaneous tissue during anagen phase in the AAE groups (Figure 1(c)). A significant difference between the 4°C group and the control group was also observed.

During the anagen phase, the hair bulb moved deeper into the dermis and reached its deepest position within the subcutaneous fat. Therefore, the distance between the hair germ and the subcutaneous layer was the shortest during this phase. In the current study, the distance in both AAE groups (4°C and 100°C) was significantly shorter than in the control group (Figure 1(d)). Moreover, the number of hairs in both AAE groups was greater than in the control group, as shown in the histology photograph in Figure 1(d).

 

Расстояние между зародышем волоса и подкожным слоем может быть использовано для определения фазы роста волос [15]. На основании этих измерений, мы обнаружили, что луковицы волосяных фолликул в фазе анагена были более тесно связаны с жировой тканью в группах ВПЭ, указывая, что фолликулы проникли глубже в подкожную ткань во время фазы анагена в группах  ВПЭ (рис 1 (с) ). Наблюдалось также существенное различие между 4°C группой и контрольной группой.

Во время фазы анагена, волосяная луковица продвинулась вглубь дермы и достигла своего глубочайшего положения в подкожно-жировой клетчатке. Таким образом, расстояние между зародышем волоса и подкожным слоем было кратчайшим в течение этой фазы. В данном исследовании, расстояние в обеих группах ВПЭ (4°С и 100°С) было значительно короче, чем в контрольной группе (рис 1 (d)). Кроме того, количество волос в обеих группах ВПЭ было больше, чем в контрольной группе, как показано на гистологической фотографии на рисунке 1 (d).

 

3.2. Immunohistochemical Analysis of BrdU Retention in Matrix and Outer Root Sheath

Since hair follicle formation during anagen requires cell proliferation in the matrix, BrdU incorporation was used to investigate whether the increase in hair shaft growth was due to hyperproliferation in the matrix region. Results indicated that both AAE groups dramatically increased cell proliferation in the hair matrix and bulge regions during anagen phase (Figures 2(a)–2(f)). Moreover, when cell proliferation in a section of the hair follicle was quantified at day 10, an increase in the number of positive cells was observed (Figure 2(g)). Both transverse and vertical sections showed that BrdU incorporation in AAE groups was significantly increased compared to control group (Figures 2(a)–2(f)). The BrdU labeling index in AAE groups was significantly higher than in vehicle control, especially in the hair matrix (Figures 2(a)–2(f), open arrows) and the outer root sheath (Figures 2(a)–2(f), diamond arrows), which contained a subpopulation of outer root sheath cells located in the middle portion of a follicle at the arrector pili muscle attachment site (the niche shown in Figure 2(h)). Data shown represents the mean ± standard deviation (SD) of three independent experiments. One-way ANOVA. was used to compare groups, followed by Dunnett’s -test.

 

3.2. Иммуногистохимический анализ  БрдУ-окрашивания  сохранения в матрице и внешней корневой  оболочке

Так формирование волосяного фолликула во время анагена требует пролиферацию клеток в матрице,  БрдУ включение было использовано, чтобы исследовать было ли увеличение роста волоса связано с гиперпролиферацией в матричной области. Результаты показали, что в обеих группах ВПЭ резко возросла пролиферация клеток в волосяной матрице и выпуклость областей в фазе анагена (рис. 2 (а) -2 (f)). Кроме того, при пролиферации клеток в секции волосяного фолликула количественно на 10-й день, наблюдалось увеличение числа положительных клеток (рисунок 2 (g)). Обе поперечные и вертикальные секции показали, что включение БрдУ в ВПЭ группы значительно увеличилось по сравнению с контрольной группой (рисунки 2 (а) -2 (f)). Индекс БрдУ маркировки в ВПЭ группах был значительно выше, чем в контрольной группе, особенно в волосяной матрице (рис 2 (а) — 2 (f), открытые стрелки) и внешнем корне оболочки (рисунки 2 (а) — 2 (f), алмазные стрелки), в котором содержится субпопуляция внешних корневых  клеток оболочки, расположенных в средней части фолликулы на месте  узелка крепления мышцы (ниши, показанной на рисунке 2 (h)). Приведенные данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение (СО) трех независимых опытов. Односторонний AНOВA (дисперсионный анализ дисперсии, статистический метод, в котором изменение набора наблюдений делится на отдельные компоненты) использовали для сравнения групп, а затем  тест Даннетта.

 

Figure 2: Immunohistochemical analysis of BrdU retention in matrix and outer root sheath region. BrdU staining in hair follicles from 7-week-old C57BL/6 mice treated with water, 100°C and 4°C AAE at 100x magnification. ((a)–(c)) Vertical section BrdU incorporation cell in matrix part in the water, 100°C AAE and 4°C AAE group (open arrows indicated BrdU-positive cells). ((d)–(f)) Transverse sections BrdU incorporation cell in outer root sheath part in the water, 100°C AAE and 4°C AAE groups (diamond arrows indicated BrdU-positive cells). (g) Number of BrdU-positive cell in a fixed area with a width of 300 μm. (h) Schematic diagram of a hair follicle showing key components. Abbreviations: HS: hair shaft; M: hair matrix; IRS: inner root sheath; ORS: outer root sheath. Scale bars are 100 μm.

Рисунок 2: Иммуногистохимический анализ  БрдУ-окрашивания удержания в матрице и районе внешней оболочки корня. БрдУ окрашивание в волосяных фолликулах от 7-недельных C57Бл/6 мышей, обработанных водой, 100°С и 4°C ВПЭ в 100-кратном увеличении. ((а) — (с)) Вертикальное сечение БрдУ-окрашенное включение клеток в матричной части в воде, 100°С ВПЭ и 4°С ВПЭ группа (открытые стрелки указанные  БрдУ-положительных клеток). ((d) — (f)) Поперечные сечения БрдУ-окрашенного включения клетки во внешней корневой  части оболочки в воде, 100°C ВПЭ, и 4°С ВПЭ группы  (алмазные стрелки указывали БрдУ-положительные клетки). (g) Количество БрдУ-положительных клеток в фиксированной области с шириной 300 мкм. (h)  Схематическая диаграмма волосяной фолликулы, показывающая ключевые компоненты. Сокращения:  ВС: волосяной стержень; М: волосяная матрица; I ВКО: внутренняя корневая оболочка;  ВОК: внешняя оболочка корня. Масштаб  полос  100 мкм.

3.3. BrdU Incorporation during S-Phase of Anagen

BrdU immunodetection was used to quantify proliferating cells in hair follicles during the growth phase (S-phase). BrdU-positive cells were observed in the hair follicle outer root sheath, matrix cells of the hair shaft, and the follicle papilla. After being injected with AAE (4°C and 100°C), the number of labeled cells which were in S-phase increased dramatically in the mouse matrix region, hair shaft, and the follicle papilla part. (Figure3).

 

3.3.  БрдУ окрашенное включение в течение С-фазы анагена

 

В иммунообнаружении был использован БрдУ для количественного определения пролиферирующих клеток в волосяных фолликулах в течение фазы роста (С-фаза). БрдУ-позитивные клетки наблюдались в волосяной фолликуле внешней оболочки корня, матричных клетках волосяного стержня и фолликулярном сосочке. После инъекции  ВПЭ (4°С и 100°С), количество меченых клеток, которые были в С-фазе резко возросло в матричной области мыши, волосяном стержне и фолликулярной сосочковой части. (Рис.3).

 

Figure 3: Immunohistochemical staining of BrdU incorporation in S-phase in anagen. ((a)–(c)) Paraffin sections from a 7-week-old C57BL/6 mouse injected with bromodeoxyuridine 48 h before necropsy, at magnification 100x. LRC could be seen in the matrix and the follicle papilla after labeling during the onset of anagen. Note the high proliferation rate (number of brown nuclei) in AAE-treated animals ((b) and (c)) compared to the control (a), with (d) showing the number of S-phase cells during anagen phase in different hair follicle regions. M: matrix, FP: follicle papilla, and HS: hair shaft. Scale bars are 100 μm.

Рисунок 3: Иммуногистохимическое окрашивание БрдУ включения в С-фазе анагена. ((а) — (с)) Парафиновые срезы из 7-недельных C57Бл/6 мышей, которым вводили бромдезоксиуридин за 48 ч до аутопсии, при увеличении 100x. УМК можно увидеть в матрице и фолликулярном сосочке после маркировки во время наступления анагена. Обратите внимание на высокую скорость пролиферации (количество коричневых ядер) с ВПЭ-обработанных животных ((б) и (в)) по сравнению с контролем (а), с (d) показывая количества С-фазных клеток в процессе фазы анагена в областях с различной волосяной фолликулой. М: матрица, ФС: фолликулярный сосочек, и  ВС: волосяной стержень. Масштаб полос 100 мкм.

  1. Discussion

In the current study, the potential role of deer antler extract (AAE) in promotion of hair growth via regulation of cell proliferation in the hair follicle region was investigated.

Histological analysis revealed that mice hair follicles treated with AAE were dramatically stronger and contained more proliferating cells than vehicle control, with longer and sturdier hair, as well as more hairs in the flourishing growth phase. The effect of stimulating hair growth was superior in the 4°C AAE group than in the 100°C AAE group. Althought here was, no significant effect on elongation of hair length or increasing hair follicle diameter, the hair anagen phase was more obviously extended. Mechanisms that subsequently observed stimulation of hair growth remained to be determined. In traditional Chinese medicine, deer antler was sliced very thinly and typically boiled for several hours to release the gelatin (protein components) [16]. Therefore, two extraction temperatures were tested: 100°C (based on traditional usage) and 4°C (based on the biological optimum). AAE contains many cytokines, dehydrogenases, alkaline phosphates, and many essential amino acids [17]. A high temperature, such as 100°C, was likely to result in protein denaturation [18]. As such, enzymatic activity in 100°C AAE was likely less than in 4°C AAE. In this study, BrdU, a synthetic nucleoside analogue of thymidine that is incorporated into newly synthesized DNA of replicating cells (S-phase of the cell cycle), was used to detect proliferating cells in living tissues [19, 20]. The BrdU labeling index in both AAE groups was significantly higher than the vehicle group, especially in the hair matrix and outer root sheath part (Figures 2(a)–2(f)). Hair follicle stem cells are thought to be slow cycling cells [21], which, in addition to high proliferative potential, is a characteristic feature of stem cells [22]. Cells stained with BrdU are referred to as label-retaining cells (LRC) [23, 24].

 

  1. Дискуссия

В текущем исследовании, была изучена потенциальная роль водного пантового экстракта оленей (ВПЭ) в продвижении роста волос через регулирование пролиферации клеток в области волосяной фолликулы.

Гистологический анализ показал, что у мышей волосяные фолликулы, обработанные  ВПЭ были гораздо сильнее и содержали больше пролиферирующих клеток, чем контрольные средства, с более длинными и крепкими волосами, а также больше волосков в процветающей фазе роста. Эффект стимуляции волосяного роста превосходил в 4°С  ВПЭ группе, чем в 100°С ВПЭ группе. Однако здесь не было никакого существенного  эффекта на удлинение длины волос или увеличения диаметра волосяного фолликула, волос анаген фазы был более явно продлен. Механизмы, которые впоследствии способствовали  стимуляции волосяного роста, еще предстояло определить. В традиционной Китайской медицине, панты оленя нарезались очень тонкими слоями и, как правило,  кипятили в течение нескольких часов, чтобы освободить желатин (белковые компоненты) [16]. Таким образом, две температуры  выварки  тестировались: 100°C (на основе традиционного использования) и 4°C (на основе биологического оптимума).  ВПЭ содержит много цитокинов, дегидрогеназ, щелочных фосфатов и многие незаменимые аминокислоты [17]. Высокая температура, например, 100°C, вероятно, приведет к денатурации белка [18]. Таким образом, ферментативная активность при 100°C  ВПЭ, скорее всего, меньше, чем в 4°C ВПЭ. В этом исследовании,  БрдУ-окрашивания, синтетический аналог нуклеозида тимидина, который включен во вновь синтезированную ДНК реплицированных клеток (С-фаза клеточного цикла), был использован для обнаружения пролиферирующих клеток в живых тканях [19, 20]. Индекс БрдУ маркировки в обеих группах ВПЭ был значительно выше, чем в группе контрольных движущихся средств, особенно в волосяной матрице и внешней части корневой оболочки (рис. 2 (а) -2 (е)). Волосяные фолликулярные стволовые клетки, как полагают, должны быть медленными циклическими клетками [21], что в дополнение к высокому пролиферативному потенциалу, является характерной чертой стволовых клеток [22]. Клетки, окрашенные БрдУ, называют удерживающими метки клетками (УМК) [23, 24].

 

Presumably because stem cells are highly proliferative during development, they can be labeled with BrdU during the neonatal period. Studies in mice clearly demonstrate that LRC are present in both the epidermis and the hair follicle bulge [25]. In the hair follicle, Rizvi and Wong [26] determined that stem cells are located in the outer root sheath and the hair matrix around the dermal papilla [27], which is consistent with data from the current study.

Several possible explanations as to why AAE may stimulate cell proliferation in the follicle region have been proposed. For instance, AAE contains high levels of insulin-like growth factor (IGF)-1 especially in tip part which were reported in our previous study [6]; we isolated the IGF-1 from fresh antler tissue and we purified of protein [28]. IGF-1 is a low molecular weight protein of roughly 7 kDa that may stimulate hair growth, as it is critically involved in regulating cellular proliferation and migration during the development and growth cycles of hair follicles [29]. Suttie et al. [30] showed that plasma levels of IGF-I, but not IGF-II, were significantly elevated during velvet antler growth in red deer. Furthermore, velvet antler growth rate has been strongly correlated with increasing levels of IGF-I in plasma. Lastly, IGF-I and II are polypeptide hormones known to stimulate cell proliferation [31], as well as DNA synthesis and matrix production [27].

Vimentin, which is also one of the most abundant proteins in deer antler [3], is recently used to inhibit hair loss through the functions of promoting the proliferation of dermal papilla cells and increasing cell migration and growth factor expression [32].

Предположительно, так как стволовые клетки обладают высокой пролиферативной активностью во время разработки, они могут быть помечены  БрдУ в неонатальном периоде. Исследования на мышах наглядно демонстрируют, что УМК присутствуют как в эпидермисе, так и волосяных фолликулярных выпуклостях [25]. В волосяной фолликуле, Ризви и Вонг [26] определили, что стволовые клетки находятся во внешней корневой оболочке и волосяной матрице вокруг кожного сосочка [27], что согласуется с данными текущего исследования.

Несколько возможных объяснений того, почему ВПЭ может стимулировать пролиферацию клеток в области фолликулы, было предложено. Например, ВПЭ содержит высокие уровни инсулиноподобного фактора роста (ИФР)-1, особенно в кончиковой части,  о чем сообщалось в нашей предыдущей работе [6]; мы выделили ИФР-1 из свежей ткани панта и очистили от белка [28]. ИФР-1 является низко молекулярным белком с весом примерно 7 кДа,  что может стимулировать волосяной рост, так как это критически  вовлекается в регуляцию клеточной пролиферации и миграцию в течение развития и роста циклов волосяных фолликул [29].  Сатти и др. [30] показали, что плазменные уровни ИФР-I, но не ИФР-II, были значительно увеличены во время бархатного пантового роста у благородного оленя. Кроме того, темп роста бархатного панта значительно коррелирован с увеличением уровня ИФР-I в плазме. Наконец, ИФР-I и II являются полипептидными гормонами, которые, как известно, стимулируют клеточную пролиферацию [31], а также синтез ДНК и матричное производство [27].

Виментин, который также является одним из наиболее распространенных белков в оленьих пантах [3], в последнее время используется для торможения потери волос через функции стимулирования пролиферации дермальных сосочковых клеток и увеличения клеточной миграции, и выраженному фактору роста [32].

 

In 2002, Yegorova [33] reported that deer antler may inhibit 5-reductase, thus reducing undesirable levels of dihydrotestosterone (DHT), maintaining testosterone levels and avoiding production of undesirable metabolites [34]. DHT is the primary contributing factor in male pattern baldness, which is referred to as androgenetic alopecia. Androgenetic alopecia is a dihydrotestosterone- (DHT-) mediated process, characterized by continuous miniaturization of androgen-reactive hair follicles and perifollicular fibrosis of follicular units, which are detected by histological examination [35]. Retention of late anagen follicles as well as increasing follicular length and prevention of their miniaturization might therefore be attributed to 5-reductase inhibitory activity. Male balding involves a change in the hair cycle and size of hair follicles. The reduction in anagen duration predominates so that the overall effect is a shortening of the hair cycle.

Velvet antler is living tissue that grows at a rate of up to 2 cm/day in some species. Cartilage, bone, and supporting tissues, such as nerves, blood vessels, and hair follicles, of the antler also exhibit accelerated growth. It is believed that factors that drive rapid regeneration of velvet antler may explain the observed health benefits of traditional Chinese medicines prepared from velvet deer antler. A wide variety of growth factors can be found in velvet and may be associated with its growth-promoting activity. Some key components in velvet deer antler include lysophosphatidylcholine, which possesses hypotensive activity [36], improving circulation and regulating blood flow, which is essential for stimulation of the scalp and hair growth.

Identification of individual active components of deer antler will require further research. In the current study, it was demonstrated that selecting functional factors in deer antler may play an important role in regulating the hair cycle and promoting hair cell proliferation in rodents. Deer antler may therefore provide a potential new treatment to promote hair regrowth.

В 2002 году, Егорова [33] сообщили, что  панты оленя могут препятствовать 5-редуктазы, тем самым уменьшая нежелательные уровни дигидротестостерона (ДГТ), поддержание уровней тестостерона и избегания производства нежелательных метаболитов [34]. ДГТ является основным фактором, способствующим облысению у мужчин, который называют андрогенной алопецией. Андрогенетическая алопеция является дигидротестостероновым (ДГT-) опосредованным процессом, характеризуется непрерывной миниатюризацией андроген-реактивных волосяных фолликул и перифолликулярного фиброза фолликулярных единиц, которые обнаруживаются при гистологическом исследовании [35]. Поэтому удержание последних  анагенных фолликул, а также увеличение фолликулярной длины и предотвращение их миниатюризации можно отнести к 5-редуктазы ингибиторной активности. Мужское облысение включает в себя изменение волосяного цикла и размера волосяных фолликул. Сокращение в анагенной продолжительности преобладает, так что общий эффект укорачивания волосяного цикла.

Бархатный пант это живая ткань, которая растет в размере до 2 см/день у некоторых видов. Хрящ, кость, и поддерживающие ткани, такие как нервы, кровеносные сосуды, и волосяные фолликулы панта также демонстрируют ускоренный рост. Считается, что факторы, влияющие на быстрое восстановление бархатных пант могут объяснить наблюдаемые преимущества для здоровья препаратов традиционной Китайской медицины из бархатных оленьих пант. Широкое разнообразие факторов роста возможно найти в бархате и может  связано с его стимулирующей рост активностью. Некоторые ключевые компоненты в бархатных оленьих пантах включают лизофосфатидилхолин, который обладает гипотензивным действием [36], улучшая кровообращение и регулируя поток крови, что очень важно для стимуляции кожи головы и волосяного роста.

Идентификация отдельных активных компонентов оленьего панта потребует дальнейшего исследования. В текущем изучении было показано, что при выборе функциональные факторы оленьего панта могут играть важную роль в регулировании волосяного цикла и содействии распространения волосяных клеток у грызунов. Поэтому панты оленя могут стать потенциально новым лечением для продвижения  восстановления волос.

  1. Conclusions

These results indicate that deer antler aqueous extract promotes hair growth by extending the anagen phase and regulating cell proliferation in the hair follicle region. We suggest that some unidentified functional factors in deer antler, such as IGF-1, may play a role in regulating the hair cycle and follicle cell proliferation in rodents.

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests regarding the publication of this paper.

  1. Выводы

Эти результаты показывают, что водный пантовый олений экстракт способствует росту волос путем расширения анагенной фазы и регуляции клеточной пролиферации в волосяной фолликулярной области. Мы полагаем, что некоторые неизвестные функциональные факторы оленьего панта, такие как ИФР-1, могут играть роль в регуляции волосяного цикла и фолликулярной клеточной пролиферации у грызунов.

Столкновение интересов

Авторы заявляют, что нет никакого конфликта интересов относительно публикации этой   статьи.

Литература

References

  1. B. Wislocki and C. M. Waldo, “Further observations on the histological changes associated with the shedding of the antlers of the white-tailed deer (Odocoileus virginianus Borealis),” The Anatomical record, vol. 117, no. 3, pp. 353–375, 1953. View at Google Scholar· View at Scopus
  2. Li, Z. Jiang, G. Jiang, and J. Fang, “Seasonal changes of reproductive behavior and fecal steroid concentrations in Pére David’s deer,” Hormones and Behavior, vol. 40, no. 4, pp. 518–525, 2001. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  3. Sui, H. Yuan, Z. Liang et al., “An activity-maintaining sequential protein extraction method for bioactive assay and proteome analysis of velvet antlers,” Talanta, vol. 107, pp. 189–194, 2013. View at Google Scholar
  4. S. Ditchkoff, L. J. Spicer, R. E. Masters, and R. L. Lochmiller, “Concentrations of insulin-like growth factor-I in adult male white-tailed deer (Odocoileus virginianus): associations with serum testosterone, morphometrics and age during and after the breeding season,” Comparative Biochemistry and Physiology A, vol. 129, no. 4, pp. 887–895, 2001. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  5. M. Barling, A. K. W. Lai, and L. F. B. Nicholson, “Distribution of EGF and its receptor in growing red deer antler,” Cell Biology International, vol. 29, no. 3, pp. 229–236, 2005. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  6. Gu, E. Mo, Z. Yang et al., “Expression and localization of insulin-like growth factor-I in four parts of the red deer antler,” Growth Factors, vol. 25, no. 4, pp. 264–279, 2007. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  7. J. Goss, “Future directions in antler research,” Anatomical Record, vol. 241, no. 3, pp. 291–302, 1995.View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  8. Laky, Z. Qu, E. Ho, C. Ulm, M. Matejka, and X. Rausch-Fan, “The effect of deer antler growth factor on the viability and proliferation of primary human alveolar osteoblast cells in vitro,” International Journal of Stomatology & Occlusion Medicine, vol. 2, pp. 175–178, 2010. View at Google Scholar
  9. Kužmová, L. Bartoš, R. Kotrba, and G. A. Bubenik, “Effect of different factors on proliferation of antler cells, cultured in vitro,” PLoS ONE, vol. 6, no. 3, Article ID e18053, 2011. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  10. Gu, E. Mo, Z. Yang et al., “Effects of red deer antlers on cutaneous wound healing in full-thickness rat models,” Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, vol. 21, no. 2, pp. 277–290, 2008. View at Google Scholar· View at Scopus
  11. Dry, “The coat of the mouse (Mus musculus),” Journal of Genetics, vol. 16, pp. 287–340, 1926. View at Google Scholar
  12. Alonso and E. Fuchs, “The hair cycle,” Journal of Cell Science, vol. 119, no. 3, pp. 391–393, 2006. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  13. H. Yang, L. Gu, D. Zhang et al., “Red deer antler extract accelerates hair growth by stimulating expression of insulin-like growth factor I in full-thickness wound healing rat model,” Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, vol. 25, pp. 708–716, 2012. View at Google Scholar
  14. P. Hee, H. L. Do, G. P. Sung et al., “Proteome analysis of red deer antlers,” Proteomics, vol. 4, no. 11, pp. 3642–3653, 2004. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  15. B. Chase, “Growth of the hair,” Physiological Reviews, vol. 34, no. 1, pp. 113–126, 1954. View at Google Scholar· View at Scopus
  16. S. Kawtikwar, D. A. Bhagwat, and D. M. Sakarkar, “Deer antlers- traditional use and future perspectives,” Indian Journal of Traditional Knowledge, vol. 9, no. 2, pp. 245–251, 2010. View at Google Scholar· View at Scopus
  17. E. Kuhlman, R. Rainey, and R. O’Neill, “Biochemical investigations of deer antler growth,” The Journal of Bone & Joint Surgery, vol. 45, pp. 345–350, 1962. View at Google Scholar
  18. N. De Wit and G. A. Swinkels, “A differential scanning calorimetric study of the thermal denaturation of bovine beta-lactoglobulin. Thermal behaviour at temperatures up to 100 °C,” Biochimica et Biophysica Acta, vol. 624, no. 1, pp. 40–50, 1980. View at Google Scholar· View at Scopus
  19. J. S. Smith, E. A. Howes, and J. E. Treherne, “Cell proliferation in the repairing adult insect central nervous system: incorporation of the thymidine analogue 5-bromo-2-deoxyuridine in vivo,” Journal of Cell Science, vol. 95, no. 4, pp. 599–604, 1990. View at Google Scholar· View at Scopus
  20. Lehner, B. Sandner, J. Marschallinger et al., “The dark side of BrdU in neural stem cell biology: detrimental effects on cell cycle, differentiation and survival,” Cell and Tissue Research, vol. 345, no. 3, pp. 313–328, 2011. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  21. M. Lavker, T.-T. Sun, H. Oshima et al., “Hair follicle stem cells,” Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings, vol. 8, no. 1, pp. 28–38, 2003. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  22. Cotsarelis, P. Kaur, D. Dhouailly, U. Hengge, and J. R. Bickenbach, “Epithelial stem cells in the skin: definition, markers, localization and functions,” Experimental Dermatology, vol. 8, no. 1, pp. 80–88, 1999. View at Google Scholar· View at Scopus
  23. J. Morris and C. S. Potten, “Highly persistent label-retaining cells in the hair follicles of mice and their fate following induction of anagen,” Journal of Investigative Dermatology, vol. 112, no. 4, pp. 470–475, 1999. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  24. R. Bickenbach, “Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin,” Journal of Dental Research, vol. 60, pp. 1611–1620, 1981. View at Google Scholar· View at Scopus
  25. Cotsarelis, T.-T. Sun, and R. M. Lavker, “Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis,” Cell, vol. 61, no. 7, pp. 1329–1337, 1990. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  26. Z. Rizvi and M. H. Wong, “Epithelial stem cells and their niche: there’s no place like home,” Stem Cells, vol. 23, no. 2, pp. 150–165, 2005. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  27. Ohlsson, A. Nilsson, O. G. P. Isaksson, and A. Lindahl, “Effect of growth hormone and insulin-like growth factor-I on DNA synthesis and matrix production in rat epiphyseal chondrocytes in monlayer culture,” Journal of Endocrinology, vol. 133, no. 2, pp. 291–300, 1992. View at Google Scholar· View at Scopus
  28. LiJuan, M. Eunkyoung, F. ZheMing, S. BaiShen, Z. XueMei, and S. Changkeun, “Partial purification and quantification of insulin-like growth factor-I from red deer antler,” Journal of Life Science, vol. 17, pp. 1321–1329, 2007. View at Google Scholar
  29. Y. Su, J. G. Hickford, R. Bickerstaffe, and B. R. Palmer, “Insulin-like growth factor 1 and hair growth,” Dermatology Online Journal, vol. 5, no. 2, article 1, 1999. View at Google Scholar· View at Scopus
  30. M. Suttie, P. F. Fennessy, I. D. Corson et al., “Pulsatile growth hormone, insulin-like growth factors and antler deveopment in red deer (Cervus elaphus scoticus) stags,” Journal of Endocrinology, vol. 121, no. 2, pp. 351–360, 1989. View at Google Scholar· View at Scopus
  31. C. Slootweg, W. W. Most, E. Van Beek, L. P. C. Schot, S. E. Papapoulos, and C. W. G. M. Lowik, “Osteoclast formation together with interleukin-6 production in mouse long bones is increased by insulin-like growth factor-I,” Journal of Endocrinology, vol. 132, no. 3, pp. 433–438, 1992. View at Google Scholar· View at Scopus
  32. H. Chung, Y. S. Jang, and H. S. Jang, “Composition comprising vimentin for inhibiting hair loss or promoting hair growth,” Google Patents, 2013.
  33. Yegorova, “Composition and method for increasing testosterone levels,” A. G. Braswell, Ed., 2002. И. Егорова, «Состав и способ повышения уровня тестостерона», А.Г. Брасвел, ред., 2002.
  34. -X. Wang, X.-H. Zhao, S.-B. Qi et al., “Effects of repeated administration of deer antler extract on biochemical changes related to aging in senescence-accelerated mice,” Chemical and Pharmaceutical Bulletin, vol. 36, no. 7, pp. 2587–2592, 1988. View at Google Scholar· View at Scopus
  35. G. Yoo, J. S. Kim, S. R. Lee et al., “Perifollicular fibrosis: pathogenetic role in androgenetic alopecia,”Biological and Pharmaceutical Bulletin, vol. 29, no. 6, pp. 1246–1250, 2006. View at Publisher· View at Google Scholar · View at Scopus
  36. Tsujibo, Y. Miyake, K. Maruyama, and Y. Inamori, “Hypotensive compounds isolated from alcohol extract of the unossified horn of Cervus elaphus L. var. xanthopygus Milne-Edwarg (Rokujo). I. Isolation of lysophosphatidyl choline as a hypotensive principle and structure-activity study of related compounds,” Chemical and Pharmaceutical Bulletin, vol. 35, no. 2, pp. 654–659, 1987. View at Google Scholar· View at Scopus